تشخیص بیماری سل ریوی با استفاده از روش‌های نوین

مقدمه

بیماری سل هرچند بیماریی قدیمی محسوب می‌شود، ولیکن به‌عنوان معضل بزرگ بهداشتی در دنیا مطرح می‌باشد. عامل ایجاد آن باسیل مقاوم به اسید و الکل بنام مایکوباکتریوم توبرکلوزیس است. طبق گزارش سازمان بهداشت جهانی، سل یکی از ۵ بیماری مهمی است که باعث مرگ‌ومیر وسیع مبتلایان در دنیا می‌شود، بنابراین جهت تشخیص سریع این بیماری و همچنین درمان به‌موقع آن لازم است روش‌های نوین تشخیصی جایگزین روش‌های قدیمی مثل لام مستقیم و کشت‌ شده تا تشخیص میکروب را از بیش از چهار هفته به کمتر از یک روز کاهش دهد. روش P.C.R به‌عنوان یک روش اختصاصی و معتبر در تشخیص مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و روش الایزا به به‌عنوان یک تست خوب جهت غربالگری عمومی پیشنهاد می‌گردد که می‌توانند به‌عنوان تست‌های مکمل در کنار روش‌های روتین یعنی کشت و لام مستقیم جهت بالا بردن ضریب اطمینان بکار گرفته شوند.

۱- روش کاری

۱-۱- نمونه‌گیری

از هرکدام از بیمارانی که صرفاً از نظر بالینی مشکوک به بیماری تشخیص داده شده‌اند و به آزمایشگاه ارجاع داده شده‌اند، نمونه خلط برای آزمایش PCR و لام مستقیم و کشت و نمونه خون جهت آزمایش الایزا گرفته خواهد شد.

نمونه‌های خلط ابتدا طی مراحل زیر به‌صورت هموژن درمی‌آیند:

• نمونه خلط گرفته‌شده را داخل یک لوله درپیچ‌دار ریخته و هم‌حجم آن سود ۴% اضافه نموده و کاملاً مخلوط می‌کنیم و به مدت ۳۰ دقیقه در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی‌گراد قرار داده در این مدت گاهی آن را تکان می‌دهیم.
• بعد از انکوباسیون، لوله را ۳۰ دقیقه در سرعتg ۱۵۰۰ سانترفیوژ می‌کنیم و مایع رویی را کاملاً خالی می‌کنیم.
• یک قطره فنل‌رد ۱% به رسوب اضافه کرده، با اسید کلریدریک ۸% آن را خنثی می‌نماییم و PH را به ۷ می‌رسانیم.

نمونه فوق جهت تهیه لام و دید مستقیم و کشت و انجام تست P.C.R قابل استفاده می‌باشد. نمونه اول برای انجام آزمایش لام مستقیم جهت بررسی وجود یا عدم وجود باسیل سل به روش زیل– نلسون رنگ‌آمیزی شده، نمونه دوم جهت کشت در محیط اختصاصی لوین اشتاین جانسون آگار کشت داده می‌شود و نمونه سوم در لوله‌های درپیچ‌داری ریخته شده و به همراه مشخصات کامل بیمار و آدرس و محل ارسال جهت انجام آزمایشP.C.R  در اختیار آزمایشگاه قرار داده می‌شود.

۱-۲- اسمیر مستقیم

از نمونه خلط هموژن‌شده بر روی لام، اسمیر تهیه کرده و پس از رنگ‌آمیزی با روش زیل- نلسون در زیر میکروسکوپ با عدسی X ۱۰۰ به‌طور دقیق ۳۰۰ میدان را بررسی و نتیجه را یادداشت می‌کنیم. در صورت نبودن باسیل در ۳۰۰ میدان میکروسکوپی، نتیجه را منفی در نظر می‌گیریم.

۱-۳- کشت

نمونه خلط  تهیه‌شده به روش هموژن را در محیط کشت لوین اشتاین جانسون آگار کشت داده و درانکوباتور ۳۷ درجه قرار می‌دهیم و تحت ۱۰%-۵% CO۲ نگهداری و بعد از ۸-۴ هفته مورد بررسی از نظر رشد باکتری سل قرار می‌دهیم.

۱-۴- تشخیص‌ مایکو باکتریوم توبرکلوزیس به روش P.C.R

مایکوباکتریوم‌ها دارای توالی تکراری هستند و توالی‌ها غنی از C+G می‌باشند. این توالی D.N.Aهای تکراری فقط در گونه‌های مخصوصی از مایکوباکتریوم‌ها یافت می‌شوند؛ از جمله توالی  IS۶۱۱۰ در مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و  IS۹۰۰در مایکوباکتریوم پاراتوبرکلوزیس. این عناصر اختصاصی در این گونه‌ها برای هیبریداسیون پروب‌ها بکار برده می‌شوند و به‌عنوان هدف در روش P.C.R برای آشکار کردن و تعیین مایکوباکتریوم‌ها در نمونه‌های کلینیکی مورد استفاده قرار می‌گیرند.

از آنجا که قرارگیری این عناصر تکراری در ژنوم می‌تواند در جداکردن سویه‌ها مورد استفاده قرار گیرد، این عناصر تکراری DNA در شناسایی زنجیره‌ها و همچنین انگشت‌نگاری DNA بکار برده می‌شوند.

قبل از انجام آزمایش‌های دو نکته مهم باید رعایت گردد:

• باید قبل از شروع کار، لامپ V به مدت حداقل ۲ ساعت روشن بماند. این کار از طرفی باعث حذف آلودگی‌های بیولوژیک می‌گردد که ممکن است فرد را در معرض خطر قرار دهد و از طرف دیگر D.N.Aهایی که به‌طور اتفاقی وارد این فضا شده باشند را از بین می‌برد و ریسک آلودگی را کاهش می‌دهد.
• در اولین مرحله شروع کار، نمونه‌های خلط هموژن‌شده را جهت رفع آلودگی به‌مدت ۲۰دقیقه در حرارت بن‌ماری جوش ۹۵ درجه سانتی‌گراد قرار می‌دهیم تا باعث رفع آلودگی باسیل سل گردد.

۱-۴-۱- استخراج D.N.A از مایکو باکتریوم توبرکلوزیس:

جهت استخراج D.N.A از کیت‌های آماده سیناژن تحت عنوان
^TM  D.N.A ( Non- stop  Genomic D.N.A  extraction Method) استفاده می‌شود.

استفاده از محلول^TM D.N.A جهت استخراج D.N.A از خلط نیاز به ۴۰- ۳۰ دقیقه زمان داشته و نیازی به فنل و پروتئیناز K نمی‌باشد.

ابتدا توسط محلول فوق، D.N.A از سلول‌های لیزشده از مرحله قبل و انکوبه شده در ۹۰ درجه سانتی‌گراد جدا و سپس توسط دترجنت رسوب داده می‌شود. در نهایت D.N.A جداشده شسته شده و به‌وسیله اتانل نمک‌گیری می‌گردد. D.N.A بدست‍آمده با این روش جهت آزمایش P.C.R بکار برده می‌شود. در این روش از هر ۱۰۰ میکروگرم نمونه خلط ۲۰-۱۰ میکروگرم D.N.A بدست می‌آید.

مراحل استخراج D.N.A از باکتری

• ۰/۱ میلی لیتر از نمونه خلط هموژن شده را با ۰/۷ میلی لیتر از محلول ^TM N.A مخلوط کرده و به مدت ۲۰ ثانیه ورتکس می‌کنیم.
• ۰/۵ میلی لیتر ایزوپروپانول را به مخلوط بالا اضافه کرده و آنگاه با ۱۰ بار سروته کردن لوله، مواد فوق را مخلوط می‌کنیم، سپس در ۲۰- درجه سانتی‌گراد به مدت ۲۰ دقیقه قرار می‌دهیم و آنگاه به مدت ۱۰ دقیقه در دور p.m ۱۲۰۰۰ میکروفیوژ می‌کنیم.
• بعد از سانترفیوژ، با خالی نمودن لوله، آن‌ها را روی کاغذ واتمن جهت جذب مایع اضافی مانده در لوله قرار داده تا محلول رویی کاملاً خارج شود. روی رسوب باقی‌مانده در لوله، ۱ سی‌سی الکل اتانول ۷۵% اضافه نموده و ۱۰ بار با سروته کردن لوله مواد داخل لوله را به هم می‌زنیم و آنگاه به مدت ۵ دقیقه در دور p.m ۱۲۰۰۰ میکروسانترفیوز نموده و محلول روئی را بیرون می‌ریزیم و این مرحله را یک‌بار دیگر تکرار می‌کنیم و اتانل را کاملاً خارج نموده و رسوب D.N.A نهایی را بمدت ۵ دقیقه در فور ۶۵ درجه سانتی‌گراد قرار می‌دهیم.
• N.A استخراج شده در ته لوله را در ۰/۰۵ میلی‌لیتر آب مقطر استریل حل می‌کنیم. جهت حل بهتر می‌توانیم بعد از تکان دادن به مدت ۵ دقیقه در فور ۶۵ درجه سانتی‌گراد قرار دهیم. برای نگهداری طولانی مدت D.N.A می‌توان D.N.A بدست آمده را در ۰/۰۵ میلی‌لیتر بافر Tris میلی مول با PH ۵,۸ حل نموده و مایع رویی را به یک لوله جدید منتقل و در فریزر ۲۰- سانتی‌گراد نگهداری کرد.

۱-۴-۲- انجام آزمایش P.C.R

ابتدا کیت مربوط به P.C.R مایکوباکتریوم توبرکلوزیس را از فریزر بیرون آورده و به حرارت اتاق می‌رسانیم و مواد کیت را در دمای یخ قرار می‌دهیم و در صورت نیاز محلول‌های داخل کیت را جهت یکنواخت نمودن محلول در داخل لوله با دور بسیار کم سانترفیوژ می‌کنیم تا جهت بقیه مراحل آماده ‌شوند.

مراحل PCR

• در هر یک از لوله‌های تست، کنترل مثبت و کنترل منفی۰/۰۲میلی‌لیتر یا ۲۰ لاندا از مخلوط C.R) Mix (P.C.R ریخته و آنگاه روی هرکدام ۰/۳ میکرولیتر آنزیم Taq- D.N.A Polymerase اضافه کنید. کلیه لوله‌ها را با تکان دادن مخلوط کنید.
• ۰/۰۰۵ میلی‌لیتر ازN.A استخراج شده را در لوله تست ۰/۰۰۵ میلی‌لیتر از کنترل مثبت داخل کیت را به لوله کنترل مثبت ۰/۰۰۵میلی‌لیتر از کنترل منفی را به لوله کنترل منفی اضافه کرده و بعد از بستن درب کلیه لوله‌ها آن را با تکان دادن مخلوط نمایید.
• به هرکدام از لوله‌ها یک قطره روغن معدنی اضافه نمایید.
• درب لوله‌ها را بسته و به مدت ۵-۳ ثانیه در میکروفیوژ قرار داده تا مواد داخل لوله‌ها مخلوط گردد.
• لوله‌ها را به دستگاه ترموسایکلر منتقل کرده و پس از بستن درب دستگاه و برنامه‌ریزی ترموسایکلر، دکمه استارت را می‌زنیم.
• برنامه‌ریزی را جهت تکثیر N.A مایکوباکتریوم توبرکلوزیس به ترموسایکلر می‌دهیم.
• پس از پایان برنامه، N.A تولید‌شده در P.C.R را همراه کنترل مثبت و منفی و همچنین مارکر D.N.A  الکتروفورز می‌کنیم و کلیه مراحل جهت جلوگیری از آلودگی زیر هود انجام می‌گیرد.

* طرز تهیه محلول T.B.E  (Tris borate electerophoresis buffer)جهت الکتروفورز

۵۴ گرم (Tris borate) را با ۲۷/۵ گرم اسید بوریک در ۱۰۰ سی‌سی آب مقطر حل نموده، سپس به آن ۲۰ سی‌سی ( E.D.T.A.Na) ۰/۵مولار با PH ۸ اضافه می‌کنیم و سپس حجم را با آب مقطر به ۱۰۰۰ سی‌سی می‌رسانیم. از این محلول می‌توان جهت تانک الکتروفورز و تهیه ژل آگارز استفاده نمود.

* طرز تهیه ژل آگارز برای الکتروفورز

غلظت ژل باید ۲% باشد، بنابراین برای حجم ۳۰ سی‌سی ( حجم موردنیاز)، ۰/۶ گرم پودر آگارز را وزن کرده، در یک ارلن با ۳۰ سی‌سی محلول T.B.E به کمک حرارت حل می‌کنیم. ذرات آگارز باید حل شود، در غیر این صورت در حرکت D.N.A   اشکال ایجاد می‌شود. بعد از کمی خنک شدن آن را داخل قالب ژل مناسب دارای شانه جهت ایجاد چاهک ریخته و اجازه می‌دهیم آگارز شکل جامد بگیرد و پس از بستن ژل آگارز، شانه را برداشته و ژل برای بکارگیری در الکتروفورز آماده می‌شود.

* الکتروفورز DNA استخراج شده

• در زیر هود، تانک الکتروفورز ساب‌مارین را با محلول B.E به اندازه لازم پر می‌کنیم.
• ژل آماده شده را در داخل تانک الکتروفورز گذاشته، طوری که بافر در یک سانتی‌متری بالای ژل قرار می‌گیرد.
• ۰/۰۰۵ میلی‌لیتر از N.A تکثیرشده را با یک میکرولیتر محلول بارگذاری ( بروموفنل ۰/۲۰درصد و سوکروز ۴۰ درصد و آب مقطر) مخلوط می‌کنیم و آن را با استفاده از سمپلر به درون چاهک‌های ژل آگارز منتقل می‌کنیم و در هر ژل یک کنترل مثبت و یک کنترل منفی و یک سایز مارکر نیز به همراه نمونه‌ها جهت کنترل قرار می‌دهیم
• با شدت ۸۰ میلی‌آمپر به مدت ۴۵- ۳۵ دقیقه الکتروفورز می‌کنیم و پس از اتمام آن را خارج می‌کنیم.
• ژل را روی دستگاه مولد نور ماوراء بنفش قرار داده و با استفاده از نور V در اطاق تاریک ژل را بررسی می‌کنیم.
• وجود باندهای N.A به اندازه PB  ۱۶۳ و مقایسه آن با سایز مارکر و همچنین کنترل مثبت نشانگر وجود بیماری سل می‌باشد. در این مرحله می‌توانیم از باندهای تشکیل‌شده عکس‌برداری نماییم.

۱-۵- روش الیزا جهت تشخیص آنتی‌بادی‌های IgG ،IgM علیه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس

روش‌های نوین ایمونولوژیک از جمله الایزا که با استفاده از آنتی‌بادی‌های مونوکلونال IgGو IgM علیه پروتئین اختصاصی غشاء سلولی باکتری بنام پروتئین A۶۰ انجام می‌گیرد دارای Sensitivity ۷۱% در مورد IgG و ۹۸% در مورد IgM و ۱۰۰% در مورد IgG + IgM و دارای Specificity ۴۸% برای IgG و ۷۶% برای IgM و ۶۸% برای IgG + IgM می‌باشد.

نمونه‌گیری

• از بیماران مشکوک به بیماری سل که قبلاً نمونه خلط جهت بررسی این تحقیق داده‌اند، ۵ سی‌سی خون در شرایط استریل گرفته می‌شود.
• بعد از ۱۵ دقیقه، سرم نمونه‌ها را جدا نموده و در لوله‌های پیچ‌دار شماره‌گذاری شده ریخته و تا زمان آزمایش در ۲۰- درجه سانتی‌گراد گذاشته می‌شود.
• سرم‌های همولیز و لیپمیک و کدر در نتیجه کار اثر گذاشته و جواب‌های کاذب می‌دهند، لذا سعی می‌شود از این سرم‌ها استفاده نگردد و خون‌گیری مجدد انجام شود.

انجام آزمایش الایزا برای تشخیص آنتی‌بادی‌های IgG علیه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس

روش کار:

• چاهک‌های حساس‌شده با پروتئین A۶۰ را به حرارت اتاق برسانید.
• نمونه سرم مورد آزمایش را به نسبت با محلول رقیق‌کننده رقیق نمایید (۱۰۰۰ میکرولیتر رقیق‌کننده + ۱۰ میکرولیتر سرم)
• سرم مثبت ضعیف و سرم مثبت قوی کنترل داده شده در کیت را نیز درست مثل نمونه‌ها به نسبت رقیق کنید. سرم رفرانس داده شده رقیق نمی‌شود.
• ۱۰۰ میکرولیتر از سرم‌های رقیق‌شده بیماران را در چاهک‌ها که قبلاً شماره‌گذاری شده است ریخته و نمونه‌های سرم رفرانس و سرم‌های کنترل مثبت و منفی را هم در چاهک‌های جداگانه بریزید.
• چاهک‌ها را یک ساعت در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی‌گراد قرار دهید.
• بعد از زمان انکوباسیون، بافر شستشوی غلیظ را به نسبت ۱ به ۲۰ با آب مقطر دو بار تقطیر رقیق نموده، ۵ بار میکروپلیت‌ها (چاهک‌ها) را با بافر شستشو داده، سپس آن‌ها را کاملاً خشک نموده و سپس ۱۰۰ میکرولیتر آنتی‌هیومن IgG کنژوگه شده با آنزیم پر اکسیداز را در هر چاهک ریخته و به مدت ۳۰ دقیقه در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی‌گراد قرار ‌دهید. در طی این مدت M.B غلیظ را طبق دستور کیت به نسبت با محلول رقیق‌کننده رقیق‌تر کرده و سپس چاهک‌ها را ۵ بار بعد از اتمام شدن مدت انکوباسیون با بافر شستشو داده و خشک کنید.
• به‌سرعت ۱۰۰ میکرولیتر سوبسترای M.B را به هر یک از چاهک‌ها اضافه نموده و دقیقاً به مدت ۱۵ دقیقه در انکوباتور ۳۷ درجه قرار دهید.
• بعد از اتمام مدت انکوباسیون، سریعاً ۱۰۰ میکرولیتر اسید سولفوریک ۰/۵ نرمال به هر چاهک اضافه نمایید.
• نتیجه را در الایزا ریدر در طول موج ۴۵۰ نانومتر خوانده و بعد از اینکه جذب نمونه‌ها و سرم‌های رفرانس و سرم‌های کنترل مثبت و منفی در طول موج ۴۵۰ نانومتر خوانده شود، با استفاده از مقادیر بدست آمده در کاغذ لگاریتمی منحنی استاندارد را برای آنتی‌بادی IgG رسم ‌کنید.

فراپژوهش