پیشرفت‏های اخیر در تست‎های تشخیصی عفونت‏های ویروسی

چکیده

مرگ سالانه هزاران نفر در اثر بیماری‏های عفونی ویروسی نگرانی‏های سلامتی عمومی جهانی را در پی داشته است. از پاندمی‏های وخیم و عفونت‎های بسیار مسری تا موارد معمول آنفلوانزا، در اغلب موارد پیش‌آگهی بالینی متکی برتشخیص زودهنگام عامل عفونی می‌باشد، بنابراین شناسایی مؤثر پاتوژن‎های ویروسی برای کمک به مهار انتقال، ایجاد درمان مناسب و نظارت بر پاسخ به درمان، موردنیاز بوده و منجر به مدیریت و کنترل مؤثر بیماری می‌شوند. هدف از این مقاله مروری، تشریح برخی از پیشرفت‏های اخیر تکنولوژی در شناسایی ویروس‎ها از جمله واکنش زنجیره ای پلیمراز، اسپکترومتری جرمی و توالی‌یابی نسل بعد است و اینکه چگونه این تکنولوژی‎ها در تشخیص و مدیریت عفونت‎های ویروسی بکار گرفته می‌شوند. این ابزارهای قوی سرعت و کارایی در تشخیص پاتوژن‏های ویروسی را ترکیب کرده و انقلابی در حوزه‌ی تشخیص بالینی ایجاد کرده اند، اما به‌هرحال، این ابزارها ایرادهای مخصوص به خود را دارند که در این بین می‎توان به هزینه‌بر بودن آنها اشاره کرد که استفاده‌ی آنها را در بسیاری از آزمایشگاه‎ها بخصوص در مواردی که با کمبود منابع مالی مواجه هستند، با محدودیت روبرو ساخته است. برعکس، ظهور و پیشرفت تکنولوژی میکروفلوئیدس علاقه زیادی را در گروه‌های تحقیقاتی بیومدیکال به خود جلب کرده است و توانسته یک جایگزین چالش‌برانگیز برای تشخیص عفونت‎های ویروسی با هزینه‌ی کمتر را ارائه دهد.

مقدمه

پاندمی‎های جهانی خطراتی جدی برای زندگی انسان هستند. درحالی‌که ویروس‎های معین و شناخته‌شده‌ای از جمله ویروس نقص ایمنی انسان (HIV) و هپاتیت همچنان باعث مرگ میلیون‌ها نفر می‌شوند، ویروس‎های نوظهور مشکل‌زا بوده و چندین شیوع شدید در سال‎های اخیر داشته‌اند؛ برای مثال در سال ۲۰۰۲ الی ۲۰۰۳ سندرم حاد تنفسی شدید ناشی از کوروناویروس (SARS-CoV)، در سال ۲۰۰۹ آنفلوانزای خوکی A(H۱N۱) و در سال ۲۰۱۴ تب خونریزی‌ دهنده ی ابولا، مرگ هزاران نفر را در شرق آفریقا رقم زده اند.

شیوع بیماری و مرگ‌ومیر ناشی از عفونت‎های ویروسی به‌طور چشمگیری بالا است. تعداد ۳۵ میلیون نفر در سال ۲۰۱۳ به HIV آلوده شده و ۳۵۰ الی ۴۰۰ میلیون نفر حامل مزمن ویروس هپاتیت B هستند. طبق گزارش‌های سال ۲۰۱۴ سازمان جهانی بهداشت (WHO)، بیش از ۷۸۰۰۰۰ نفر هر سال در اثر هپاتیت B می‏میرند و مرگ ناشی از بیماری‎های کبدی مرتبط با هپاتیت C به بالای ۵۰۰۰۰۰ نفر می‎رسد. شیوع بالای این بیماری‏ها باعث افزایش تلاش‎ها در راستای بهبود تشخیص‌های بالینی شده است.

مهار مؤثر و مدیریت بالینی بیماری‎های عفونی به‌طور دقیق به غربالگری زودهنگام و دقیق پاتوژن‌ها بستگی دارد. غربالگری شامل تشخیص اولیه‎ی ذرات عفونی در ارگانیسم و سپس تعیین عواملی (از جمله جهش‏ها و تنوع ژنتیکی) است که مقاومت به درمان و فرار ایمنی پاتوژن را باعث می‎شوند، بنابراین، تشخیص سریع عامل عفونت‌زا سود بیمار را از طریق درمان به‌موقع و جلوگیری از عوارض بیماری تضمین کرده و همچنین سلامت عمومی را از طریق جمع‌آوری داده ‎ها برای مطالعات اپیدمیولوژیکی در راستای مهار شیوع و گسترش بیماری‎ها تأمین می‌کند. در این زمینه، سازمان بهداشت جهانی برنامه‎ های نظارتی زیادی برای کنترل بیماری‎ها از جمله استراتژی جهانی برای کنترل و ارزیابی مقاومت دارویی به HIV، نظارت جهانی آنفلوانزا و سیستم پاسخگو به کنترل و نظارت آنفلوانزا و سیاست جهانی روی هپاتیت‎های ویروسی، تدوین نموده است.

در مقیاس کوچک‌تر، آزمایشگاه‎های بالینی نقطه ی حیاتی تشخیص بیماری ویروسی با استفاده از طیف وسیعی از ابزارها و ماشین‎های متنوع از لحاظ قیمت و کارایی هستند.

در دنیای رشد سریع تکنولوژی، صنعت به‌طور مداوم ابزارهای به‌روز را ارائه می‏دهد، اما چندین فاکتور، استفاده از آن‌ها رادر حوزه ی مراقبت‎های بهداشتی در جوامع کم درآمد، محدود کرده است، که این متأسفانه منافع جهانی را به تأخیر می‌اندازد. این مقاله مروری به شرح برخی از این روش‏های ارزیابی پیشرفته پرداخته؛ اینکه چگونه با ویژگی‎های خاص خود، انقلابی در زمینه تشخیص آزمایشگاهی ایجاد کرده اند و چه کارهایی برای غلبه بر محدودیت‎های آنها می‎توان انجام داد.

اصول عمومی یک تست آزمایشگاهی مناسب

تفسیر دقیق و جدی نتایج آزمایشگاهی، مدیریت بالینی و کنترل انتشار یک بیماری را با کارایی بالا تضمین می‌کند، بااین‌حال، تشخیص اشتباه می‎تواند منجر به از دست دادن منابع مالی و انسانی شود.

نکته‎ی مهم در تست‎های بالینی بیماری‏های عفونی، تعیین دقیق وجود یا عدم وجود عامل عفونی یا آنتی‌بادی‌های مربوطه (برای تعیین اینکه فرد اخیراً یا در گذشته در معرض عامل عفونی قرار گرفته) است. بنابراین، توانایی تشخیص دقیق آلودگی یا عدم آلودگی فرد و تعیین روند عفونت، تأثیر مثبتی بر انتخاب روش‎های درمانی دارد.

سودمندی و قابل اطمینان بودن نتایج آزمایشگاهی به پارامترهای عملکردی و عملی تست موردنظر بستگی دارد. پارامترهای عملکردی به‌طور مستقیم در ارتباط با برآورد نتایج صحت، دقت، حساسیت و اختصاصیت یک تست هستند. اگرچه این پارامترها به‌صورت مقادیر آماری (درصد) هستند، ولی دارای توضیحات مختلف بوده و شامل مقایسه با روش مرجع یا “استاندارد طلایی” برای تست موردنظر می‌باشند.

صحت، نزدیکی نتایج یک تست را به نتایج حاصل از روش مرجع یا واقعی توصیف کرده و به صورت درصدی از نتایج صحیح بیان می‌شود. دقت به نتایج قابل‌اعتماد و تکرارپذیر یک آزمون روی نمونه های یکسان اشاره می‎کند و نتایج مشابهی را بدست می‎آورد.

برای حفظ قابل اطمینان بودن یک آزمون، دو پارامتر صحت و دقت باید به‌طور منظم با استفاده از روش‎های کنترل کیفیت (QC) و تضمین کیفیت (QA) تأیید‌شده در آزمایشگاه، تحت نظارت قرار گیرند. در شرایط مطلوب، یک تست ایده‌آل باید دقت و صحت ۱۰۰٪ داشته باشد، بااین‌حال، فاکتورهای خارجی و روش‎های متفاوت انجام آزمایش می‏توانند تداخلات کوچکی را ایجاد نمایند.

حساسیت (همچنین نرخ مثبت واقعی نامیده می‎شود) درصد تأییدشده از بیماران مبتلا به عفونت (با روش استاندارد طلایی) تعریف می‎شود که نتایج تست مثبت داشته اند. حساسیت معمولاً با استفاده از حد پایین تشخیص یک آنالیت با نتیجه ی مثبت بدست می‎آید.

ویژگی یا اختصاصیت (که به‌عنوان نرخ منفی واقعی نامیده می‎شود) یک ارزیابی کیفی است که نشان‌دهنده توانایی یک آزمون برای تشخیص آنالیت هدف از نوع غیرهدف است. این معیار به‌صورت درصدی از بیماران عاری از عفونت با نتیجه منفی تعریف می‎شود. هرچه مقادیر بدست‌آمده از نمونه ی تست به نمونه ی مرجع نزدیک‎تر باشد، حساسیت و اختصاصیت آزمون بالاتر است.

برعکس پارامترهای عملکردی، انواع عملی در ارتباط با سادگی و سهولت در انجام آزمایش مانند دوره کاری کامل یا زمان چرخش (TAT) می‌باشند. زمان چرخش، یک شاخص کلیدی عملکردی است که به‌عنوان فاصله زمانی بین ثبت نمونه تا گزارش نتیجه تعریف می‎شود. آماده‎ سازی نمونه و تمام مراحل انجام‌شده قبل از اندازه ‎گیری (پره‌آنالیتی) در فاصله زمانی گفته‌شده قرار می‎گیرند. یک آزمایش ایده‌آل در کمتر از ۶۰ دقیقه تمام می‎شود، در نتیجه تولیدکنندگان قصد ساخت ابزارهای تشخیصی با زمان چرخش کوتاه‌تر را دارند که یک فاکتور اختصاصی مفید برای ایجاد مراقبت‎های ویژه است.

سازمان جهانی بهداشت برای برقراری تشخیص در مراکز مراقبتی با منابع محدود، معیارهایی شامل مقرون به‌صرفه، حساس، اختصاصی، کاربرپسند، سریع و قوی، بی نیاز از تجهیزات و قابل دستیابی برای کاربر نهایی  را تدوین کرده است. هدف، تدارک بهتر مدیریت بیماری، از جمله تحویل فوری نتایج، ثبت سریع وضعیت بیماری و در نهایت بهبود اتخاذ تصمیم‌گیری‌های بالینی است.

روش‎های قدیمی آزمایشگاهی برای تشخیص عفونت‎های ویروسی

خیلی وقت است که تشخیص عفونت‎های ویروسی با استفاده از طیف وسیعی از تکنیک‎ها در آزمایشگاه‎های بالینی انجام می‎شود. برای مدت زمان طولانی است که در کشورهای توسعه‌یافته، میکروسکوپ الکترونی به‌عنوان یک ابزار کارآمد برای تشخیص مستقیم ویروس‎ها با مشاهده و شمارش ذرات ویروسی در مایعات بدن، مدفوع یا نمونه ‏های پاتولوژیک بافتی بکار گرفته می‌شود. شناسایی ویروس توسط میکروسکوپ الکترونی بر پایه‏ ی ویژگی‎های مورفولوژیکی خاص برای هر خانواده از ویروس‏ها صورت گرفته و نیاز به مقدار معینی از ذرات ویروسی (تا ۱۰۶ ذره/ میلی‌لیتر) دارد، بااین‌وجود آماده‌سازی نمونه قبل از انجام آزمایش ممکن است غلظت ویروس‎ها را کاهش داده که به‌نوبه‌ی خود تجزیه‌وتحلیل را سخت‎تر می‌کند. علاوه بر این، از آنجا که ممکن است وجود ساختارهای غیرمعمول یا مشابه مانند بقایای اندامک‌های سلولی و خود سلول‌ها توسط میکروسکوپ الکترونی به اشتباه اشکال ویروسی تلقی شود، لذا کار با میکروسکوپ الکترونی نیاز به مهارت‎های فنی و تخصصی زیادی دارد.

ترکیب روش‎های میکروسکوپ الکترونی، روش‎های مبتنی بر کشت و تست‎های سرولوژی کمک بزرگی در تشخیص عفونت‎های ویروسی و همچنین تشخیص آنتی‌بادی‌های هدف علیه این ویروس‌ها کرده است. سه روش مذکور هنوز در بسیاری از آزمایشگاه‌های بیمارستانی اساس تشخیص عفونت ویروسی می‌باشند.

یکی از محبوب‌ترین روش‏ها برای جداسازی ویروس‎ها، کشت رده‌های سلولی متفاوت است. انتخاب روش کشت با توجه به نوع ویروس انتخاب‌شده متفاوت است (به‌عنوان مثال، سلول‎های کلیه میمون رزوس برای جداسازی ویروس آنفلوانزا A استفاده می‎شوند).

رشد یک ویروس در کشت سلولی از طریق مشاهده‏ی اثر سیتوپاتیک که ویژگی‎های اختصاصی و تغییرات سلولی را نشان می‏دهد، انجام می‎گیرد. شناسایی قطعی ویروس با استفاده از رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس (IF) انجام می‌شود. البته استفاده از کشت سلولی برای جداسازی در مورد ویروس‎هایی که قادر به رشد در رده ‎های سلولی (نوروویروس، ویروس هپاتیت) یا تولید اثر سیتوپاتیک نیستند، ایده‌آل نیست.

علاوه بر این، اگر حجم‏ کوچکی از نمونه داشته باشیم، تلقیح کافی ویروس به انواع سلول‎های کشت داده‌شده صورت نگرفته و این باعث پیچیده ‏تر شدن نتیجه‏ ی کشت می‏شود؛ به‌عنوان مثال تلقیح استاندارد نمونه مایع مغزی نخاعی (CSF) به محیط کشت سلولی نیازمند حداقل ۰/۲ میلی‌لیتر نمونه است، بااین‌حال برای تلقیح به سلول‎های مختلف، نیاز به نمونه بیشتری بوده که ممکن است منجر به تهاجمی بودن روش و در نتیجه آسیب‎ رسانی به بیمار شود.

زمان لازم برای جداسازی ویروس‎ها از طریق کشت سلولی بسیار طولانی (چندین هفته) است، بنابراین زمانی که تشخیص سریع موردنیاز است، یک ایراد به‌حساب می‌آید. کشت سلولی نیاز به پرسنل مجرب و ماهر جهت تفسیر دقیق اثر سایتوپاتیک ویروس داشته و کار کردن با رده های مختلف سلول‎های پستانداران یا ویروس‎های بسیار بیماری‎زا، نیازمند امکانات کافی است.

یکی از روش‎های کشت سریع، تکنیک shell vial است که سلول‏های تلقیح‌شده، سانتریفیوژ، انکوبه و سپس توسط آنتی‌بادی‌های اختصاصی مونوکلونال علیه ویروس‎های مشکوک به ایجاد عفونت از جمله ویروس‎های تنفسی، ویروس هرپس سیمپلکس یا ویروس واریلا زوستر، جهت انجام ایمونوفلورسانس رنگ‌آمیزی می‌شوند. آنتی‌ژن‌های تولیدشده‌ی ویروسی ۲ الی ۴ روز بعد از انجام کشت سریع تشخیص داده می‌شوند. محدودیت روش کشت سریع ناشی از عدم شناسایی طیف گسترده ‏ای از ویروس‎ها و همچنین حساسیت پایین آن است.

یکی از قدیمی‎ترین روش‏ها در تاریخ ویروس ‎شناسی بالینی، تست فیکساسیون کمپلمان (CFT) است. در این تست کمپلمان فقط به‌صورت غیراختصاصی با ترکیبات آنتی‏ژن– آنتی‏بادی واکنش می‎دهد، در نتیجه، در حضور مجموعه آنتی‌ژن- آنتی‌بادی، کمپلمان آزاد نبوده تا با گلبول‌های قرمز گوسفند حساس‌شده که به‌عنوان یک شاخص استفاده می‌شود، واکنش دهد، بنابراین گلبول‌های قرمز در واکنش مصرف نمی‌شوند که نشان‌دهنده‏ ی مثبت بودن تست است.

تست فیکساسیون کمپلمان ظاهراً آسان و راحت بوده و نیاز به مواد ارزان قیمت دارد. بااین‌حال، این تکنیک طاقت‌فرسا و فاقد حساسیت لازم است. یک نکته‎ی مهم در انجام این تکنیک برای دستیابی نتیجه‏ ی مؤثر، اعمال استانداردسازی طی تیتراسیون مواد واکنش‌دهنده و تهیه نمونه ی کنترل است‏.

معمولاً تشخیص آربوویروس‏ها، زیرگونه‏ های آنفلوانزا و انواع پاراآنفلوانزا، توسط تست نسبتاً کمی مهار هماگلوتیناسیون انجام می‎شود. اساس این تست بر توانایی اتصال یک پروتئین پوششی ویروس به نام هماگلوتینین (HA) به اریتروسیت‏ها و درنتیجه تشکیل یک الگوی شبکه مانند بنام آگلوتیناسیون است. در این تست، رقت‏های متوالی از نمونه سرم به مقدار ثابت هماگلوتینین ویروسی و اریتروسیت‏های با قابلیت تشکیل آگلوتیناسیون اضافه می‏شود. اگر آنتی‏بادی‏های آنفلوانزا در سرم وجود داشته باشند، فرایند آگلوتیناسیون مهار می‏شود. میزان رقیق شدن مربوطه تا جایی که در آن هماگلوتیناسیون کامل مشاهده شود، ادامه پیدا می‌کند. اگرچه این تست از نظر کنترل کیفی وقت‏گیر است، اما علاوه بر آنفلوانزا، طیف وسیع‎تری از بیماری‏های ویروسی توسط روش‏های مختلف آگلوتیناسیون تشخیص داده می‌شوند.

این فهرست از تکنیک‎های متداول جامع نبوده و تنها مواردی که بیشتر مورد استفاده قرار می‎گیرند، ذکر شده است. در ادامه تحولات اخیر که جایگزین شیوه‏ های معمول شده‏ اند و اجازه غربالگری (آزمون کیفی)، نظارت (آزمون کمی) و تأییدیه تشخیص را می‏دهند، مورد بحث قرار خواهد گرفت.

روش‎های جدید تشخیص عفونت‎های ویروسی

همان‌طور که قبلاً ذکر شد، این مقاله تنها برخی از پیشرفت‏های اصلی در تکنولوژی‏های تشخیصی که دوره جدید ویروس‌شناسی بالینی را رقم زده‌اند را مورد بحث قرار می‌دهد و در جدول ۱ به‌طور خلاصه، به ارائه مزایا و محدودیت‌های کلیدی آنها پرداخته است.

تست‏های ایمنی‌سنجی

تولید و فعال شدن آنتی‏بادی علیه یک ماده خارجی در مواردی مانند عفونت اولیه، عود عفونت و یا طی  فعال شدن مجدد  عفونت، صورت می‏گیرد، بنابراین اندازه‌گیری سطح ایمونوگلوبولین‌ها به‌عنوان یک رویکرد گسترده برای تشخیص عفونت‏های ویروسی در نظر گرفته شده است.

کارایی مؤثر نشأت گرفته از اختصاصیت و تمایل اتصالی بالا بین آنتی‌ژن و آنتی‌بادی، روش‌های ایمنی‌سنجی خودکار را به یکی از رایج‏ترین روش‏های موجود در آزمایشگاه‌ها تبدیل کرده است. اساس این روش‏ها متکی بر تشکیل یک کمپلکس ایمنی بین آنتی‏ بادی موجود در نمونه بیمار و آنتی‌ژن مصنوعی موجود در واکنش یا برعکس، برای تولید یک سیگنال قابل اندازه گیری است.

در تست‌های ایمنی‌سنجی، آنتی‏بادی یا آنتی‌ژن‌های مصنوعی نشاندار که بر روی یک سطح جامد متصل شده‌اند به‌وسیله‌ی آنتی‏ژن یا آنتی‌بادی موجود در نمونه‌های سرم جذب می‌شوند. این نشان‌ها می‏توانند ایزوتوپ‎های رادیواکتیو یا آنزیم‎هایی باشند که سبب تغییر در رنگ یا مواد تولیدکننده نور می‌شوند. در نتیجه، این اصل روش‎های متعددی را برای انجام آزمایش ایجاد کرده است.

ایمنی‌سنجی رادیواکتیو (RIA) احتمالاً جزء روش‌های اولیه (دهه ۱۹۶۰) است که در آن از رادیوایزوتوپ‎ها (مانند ید ۱۲۵) برای نشانه‏ گذاری آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی استفاده می‌کنند. مقدار مواد آنالیز شده، از روی مقدار رادیواکتیویته تولیدشده تعیین می‌شود. RIA یک روش بسیار حساس است اما اشکال اصلی استفاده  و دفع مواد رادیواکتیو خطرناک است.

در روشی جایگزین، نشانه‌گذاری آنزیم‌ها با استفاده از آلکالین فســــــــــــــفاتاز یا HRP (horseradish peroxidase) صورت می‏گیرد، که  مدت‌ها بع عنوان روش مرجع در نظر گرفته می‌شد. این آنزیم‌ها باعث انتشار سیگنال‌ها یا تغییر رنگ شده و در نتیجه مقدار آنالایت موردنظر را اندازه‎ گیری می‎کنند. چنین روشی ایمنی‌سنجی مرتبط با آنزیم (EIA) (enzyme-linked immunoassay) نامیده می‎شود. EIA دارای انواع مختلفی از جمله الایزا است و تفاوت آنها در آنزیم مورد استفاده و اساس تشخیص سیگنال تولیدی است.

جدول ۱٫ خلاصه‌ای از روش‏های اصلی تشخیص عفونت ویروسی

واریانت‌های اصلی EIA عبارتند از:

• ایمنی‌سنجی پلاریزاسیون فلورسانس (FPIA) (Fluorescence polarization immunoassay): استفاده از برچسب فلورسنت و نور دارای قطبیت
• ایمنی‌سنجی آنزیمی میکروذرات (MEIA) (Micro-particle enzyme immunoassay): استفاده وسیعی داشته و بر مبنای آنزیم الکالین فسفاتاز و مواد سوبسترای پشتیبان است.
• ایمنی‌سنجی کمی‌لومینسنت (CLIA) (Chemiluminescent immunoassay) که از برچسب‎‎های کمی‌لومینسنت یا پراکنشگر نور استفاده می‌کند. شرکت‌هایی مانند ROCHE یا Abbot در حال بهره‏ برداری از این روش هستند. تکنولوژی CLIA دارای مزایایی مانند سرعت بالا و سهولت در اندازه‎ گیری است، در نتیجه به‌تدریج در آزمایشگاه‌های با حجم نمونه‎ ی بالا، جایگزین روش MEIA شده است.

مطالعات سرولوژی هپاتیت B در بالین، از ایمنی‌سنجی به‌عنوان یک ابزار کلیدی برای تشخیص مارکرهای ویروس هپاتیت B (HBV) استفاده می‌کند. نسخه‎ های به‌روز شده از روش‎های ایمنی‌سنجی، قادر به شناسایی پایین‎ترین سطوح مارکر اصلی  HBVبنام HBsAg هستند، درحالی‌که روش‎های معمولی قادر به تشخیص این مارکر، به‌ویژه در نمونه‎ های سرم بیماران بدون علامت نیستند. آخرین روش غربالگری ایمنی‌سنجی قادر به تشخیص کمترین میزان IU/ml۰/۰۵ نمونه است. این مقدار معادل ۲/ ۰ نانوگرم در میلی‌لیتر آنتی‌ژن ویروسی با حساسیت بالا (> ۹۹٪) بوده که در مراحل مختلف بیماری یا حتی در بیماران با سرم عاری از ویروس مشاهده می‎شود.

دستیابی به حساسیت بالا در اندازه‌گیری و اطلاعات کافی از ژنوتیپ‌های ویروس هپاتیت B توسط تکنولوژی جدید پیشرفته‎ ی CLIA مقدور شده است. تکنولوژی CLIA قادر به دناچوره کردن ذرات ویروس هپاتیت B بوده و از آنتی‏بادی‏های مونوکلونال علیه اپی‎توپ‎ های ساختاری داخلی و خارجی این پاتوژن استفاده می‌کند.

تشخیص ویروس‎ها با استفاده از انواع اتوماتیک تکنیک‌های ایمنی‌سنجی بر برخی از محدودیت‏های روش‏های مرسوم، به‌ویژه تأخیر در پاسخ‌دهی، فائق آمده است.

محدودیت‌ها

علیرغم محبوبیت ایمنی‌سنجی در آزمایش‌های بالینی، به دلایل گوناگونی گاهی نتایج نادرست تحویل می‎دهد که این مقدمه‌ی اختلاف‌نظر در انتخاب این نوع از تست‌ها است.

• ایمنی‌سنجی بیشتر از سایر روش‏ها مستعد به عوامل مداخله‌کننده است که منجر به نتایج مثبت یا منفی کاذب می‏شود. در اغلب موارد، تداخلات ناشی از حضور عوامل با شباهت ساختاری به مواد واکنش‌دهنده بوده و بسته به غلظت این عوامل و آنالیت هدف، میزان تداخل متغیر خواهد بود. در اغلب موارد عامل اصلی این تداخلات، آنتی‎بادی‏های اندوژن (آنتی‏بادی‏های خودی، آنتی‏بادی‎های ناسازگار یا آنتی‌بادی انسانی ضدحیوانی) هستند. معمولاً این عوامل به آنتی‏بادی‏های نمونه متصل می‎شوند و در غیاب آنتی‌ژن (آنالیت) هدف باعث نتیجه‌ی مثبت کاذب تست‌ می‏شوند.
•  کنترل کیفی صحیح ، نتایج قابل اطمینان را تضمین کرده و فرض را براین می‏گذارد که آزمایش خوب انجام شده است، بنابراین اندازه گیری‏های با کنترل کیفی ضعیف منجر به پایین آمدن دقت و صحت می‎شوند. در ایمنی‌سنجی، تضمین کنترل کیفی طی انجام کالیبراسیون منظم و همچنین کنترل مواد مصرفی با استفاده از راه حل‏های استانداردشده که توسط تولیدکنندگان تدوین شده است، حاصل می‌شود.
• با توجه به اینکه تست‎های ایمنی‌سنجی جزء دقیق‎ترین و حساس‎ترین روش‎های خودکار هستند، در نتیجه، یکی دیگر از معایب این روش‏ها هزینه ‏ی بالای مواد و تجهیزات، به‌ویژه برای آزمایشگاه‌های با منابع محدود است.

سنجش‌های مبتنی بر تکثیر

انقلاب در زمینه‏ ی تشخیص مولکولی توسط مولیس و فلونا در سال ۱۹۸۷ از طریق ایجاد  تکثیر اسید نوکلئیک طی واکنش زنجیره‏ای پلیمریزاسیون (PCR) به وجود آمده است. اساس این روش استخراج و تخلیص نوکلئیک اسید، تکثیر تصاعدی توالی هدف با استفاده از آنزیم پلیمراز مقاوم به دما و پرایمرهای اختصاصی است. در نهایت آمپلیکون حاصل با استفاده از سیستم تشخیصی فلورسانس محور، شناسایی و نتیجه بر مبنای واحد بین‌المللی IU/ml گزارش داده می‏شود.

بلافاصله پس از اختراع PCR، به‌منظور بهبود قابلیت‏های آن تغییرات جدیدی روی این تکنیک آزمایش و ثبت اختراع شد. برای این طیف از واریانت‏های جدید، اصطلاح تست‌های تکثیر نوکلئیک اسیدی
(NAAT) nucleic acid amplification tests بکار گرفته می‏شود.

توانایی تست‎های تکثیر نوکلئیک اسیدی در تعیین لود ویروسی باعث محبوبیت بسیار آنها در تشخیص و مدیریت عفونت‎های ویروسی (مانند HBV، HCV، HIV، ویروس‏های آنفلوانزا و …) شده است، به عبارت دیگر، این روش توانسته است طی تکثیر توالی هدف اسیدنوکلئیک ویروسی، مقدار کمی ‎سازی را تا هزاران برابر افزایش دهد. امروزه در اغلب موارد، روش‎های PCR محور به‌عنوان روش مرجع یا”استاندارد طلایی” تشخیص از جمله هنگام غربالگری خون اهداشده از نظر انتقال ویروس‏های منتقل‌شده از راه خون (CMV، HIV، HCV و …) در نظر گرفته می‌شوند.

رایج‌ترین نوع روش‏های تکثیری مرسوم عبارتند از:  PCR در زمان واقعی (real-time PCR) (PCR کمی) و PCR رونویسی معکوس (RT-PCR). در حال حاضر هر دو تکنیک به معیارهای ارزیابی لود ویروسی تبدیل شده‌اند. درحالی‌که روش اول، DNA را در تمام واکنش‏ها در زمان واقعی اندازه می‏گیرد، در روش دوم، آنزیم ترانس‌کریپتاز معکوس ابتدا mRNA را تبدیل به cDNA کرده و با ساخت رشته‏ ی مکمل، DNA حاصل را تکثیر می‏دهد. این روش همچنین مقدار RNA را اندازه‎گیری می‌کند. ترکیبی از هر دو تکنیک باعث افزایش حساسیت در شناسایی ویروس‏ها، به‌ویژه ویروس‏های آنفلوانزا می‏شود. پس از گزارش اولین مرگ ناشی از عفونت سندرم کرونای تنفسی در خاورمیانه (MERS-CoV) در سال ۲۰۱۲، سازمان بهداشت جهانی اخیراً یک روش پیشرفته و جدید از RT-PCR را تأیید کرده است.

تشخیص مناسب RNA ویروس‏ها توسط دیگر تست‏های مبتنی بر تکثیر مانند تکثیر مبتنی بر توالی نوکلئیک اسید (NASBA) و تکثیر به‌واسطه‌ی رونویسی (TMA) صورت گرفته که بدون تبدیل شدن به cDNA، خود mRNA مستقیماً تکثیر و اندازه‌گیری می‏شود.

در طراحی آخرین پیشرفت‏های سیستم PCR، مراحل استخراج، تکثیر و تشخیص در یک واحد ترکیب شده‏ اند، به‌عنوان مثال، تکنولوژی BioFire Film Array با بکارگیری دو تکثیر متوالی، شناسایی یک پنل از ویروس‏های تنفسی را با حساسیت بالا در مدت ۱ ساعت و تنها توسط یک دستگاه انجام می‎دهد.

از طرف دیگر، تکنولوژی میکروفلوئیدیس نیز از سیستم‏های مبتنی بر PCR سود می‌برد و   کاهش زمان (تا ۱۵ دقیقه)، افزایش حساسیت و مقرون به‌صرفه‌تر بودن تشخیص، را میسر می‌سازد. در اپیدمی ۲۰۰۹ ویروس آنفلوانزا H۱N۱، به‌جای استفاده از روش‏های لوله‎ ای، انواع تراشه‏ای real-time PCR بیشتر برای تشخیص بکار گرفته شدند. فرمت قابل‌حمل چنین سیستم‌هایی باعث شده است به‌راحتی طی همه‌گیری‌ها و شیوع بیماری‎ها استفاده شوند.

انواع مولتی‌پلکس (چندگانه ‏ی) تست‌های تکثیر نوکلئیک اسیدی، برای شناسایی چندین گونه یا زیرگونه ویروسی در یک دوره‎ی کاری طراحی شده است. با استفاده از پنل‏های متنوع می‌توان سیستم‏های تشخیص آنها را تا ۲۰ ویروس افزایش داد، برای مثال تشخیص همزمان عفونت‏های HAV، HBV و HCV و نیز عفونت‏های توامان ممکن می‏باشد.

طی عفونت هپاتیت B، تکنیک PCR روش استاندارد طلایی و با دقت بالا برای ارزیابی سطح DNA  مربوط به HBV است و آزمون‏ها بر اساس استاندارد بین‌المللی سازمان بهداشت جهانی برای ویروس هپاتیت B(NIBSC)، مانند تست مرجع Roche Cobas TaqMan HBV، استانداردسازی می‎شوند. این تست با حد تشخیص IU /ml ۱۰/۲، اولین آزمایش تأییدشده توسط سازمان غذا و دارو می‌باشد. سیستم ترکیبی با Cobas AmpliPrep دارای پروسه‌ی استخراج نمونه خودکار و تشخیص بسیار حساس برای تمام ژنوتیپ‏های HBV است.

در افراد مبتلا به HIV تحت درمان داروهای ضد رتروویروسی، آزمایش‏های فوق‌حساس، قابلیت سنجش کمی مقادیر نسخه‏ی کم زیرگونه‏ های HIV (کمتر از ۵۰ نسخه در میلی‌لیتر) را دارند. همچنین وجود تکرارهای طویل انتهایی ژنوم ویروس در مخازن مخفی و لیزات‏های سلولی، باعث عدم نیاز به مرحله استخراج اسید نوکلئیک شده است. چنین آزمایش‏هایی می‌توانند ابزار ارزشمندی در مطالعات بزرگ هم‎گروهی یا هنگام وقوع بیماری‏های همه‏ گیر باشند.

محدودیت‌ها

اگرچه PCR یک تکنیک مقرون به‌صرفه و قابل اطمینان در تشخیص عفونت‎های ویروسی است، اما در نظر گرفتن محدودیت‎های آن نیز حائز اهمیت است؛ ریسک آلودگی بالایی هنگام کار کردن با آن، به‌خصوص در مرحله آماده‌سازی نمونه، وجود دارد. علاوه بر این، دوره کاری real-time PCR در مقایسه با سایر تکنیک‌ها زمان طولانی‌تری (۲ تا ۵ ساعت) را به خود اختصاص می‎دهد.

در مورد آنفلوانزا، بسیاری از آزمایشات مبتنی بر PCR تنها برای شناسایی یک زیرگونه‎ی خاص از ویروس که مسئول پاندمی‎های مهم است طراحی و انجام می‎شود، از طرفی چون تکنیک PCR مستعد نتایج مثبت کاذب است، هنگام طراحی پرایمرهای مخصوص توالی هدف، داشتن اپراتورهای مجرب جهت شناسایی خطاها یک امر ضروری است، همچنین نرخ بالای جهش در برخی از ویروس‎ها بخصوص در مناطقی از ژنوم که پرایمر علیه آن طراحی شده است موجب عدم‌تشخیص ویروس با تکنیک PCR می‏شود.

توالی یابی نسل بعد (NGS)

یکی از بزرگ‌ترین دستاوردهای عصر نوین، تکنیک NGS است. علاوه بر توالی‎ یابی ژنوم موجودات شناخته‌شده، از کاربردهای این تکنیک می‏توان کشف ویروس‏های جدید مسئول بیماری‏های ناشناخته انسان، ردیابی شیوع و پاندمی بیماری‏هایی مانند آنفلوانزا در راستای درک نحوه‏ ی پیدایش و انتقال آنها را نام برد.

کشف توالی ‎یابی در دهه ۱۹۷۰ توسط سنجر و برل آغاز و سپس توسط ماکسام و گیلبرت، ادامه پیدا کرد. ماکسام و گیلبرت برای اولین بار قادر به توالی‌یابی الیگونوکلئوتیدها به روش پلیمریزاسون آنزیمی با استفاده از پرایمرهای نشانه‌گذاری شده توسط مواد رادیواکتیو شدند. آنها هنگام انجام توالی‌یابی، از دی‌دئوکسی نوکلئوتید (ddN) برای پایان دادن به مرحله‎ی گسترش پلیمریزاسون استفاده کردند، در نتیجه روش خاتمه زنجیره یا دی‌دئوکسی نوکلئوتید نام‌گذاری شد.

اگرچه از آن زمان تاکنون توالی‌یابی‎ها بر همین اصل استوار مانده‌اند، اما در مقایسه با توالی‎ یابی دی‌دئوکسی نوکلئوتید، در انواع جدید با توجه به ارائه حداکثر حجم داده، بهینه‌سازی و اتومات شدن، سرعت و دقت را به‌طور چشمگیری افزایش داده است. از لحاظ فنی، NGS شامل سه مرحله اصلی است: آماده‌سازی نمونه، توالی‌یابی و آنالیز داده ‎ها. سیستم‌های موجود در بازار اغلب از دیدگاه توالی‌یابی یا خوانش توالی، تکنیک‌های متفاوتی را دارا هستند. در راستای ارائه دقیق خوانش توالی‎ های طویل‌تر در کوتاه‎ترین زمان و با هزینه کمتر، امروزه تشخیص بالینی عفونت ویروسی با استفاده از NGS به‌طور چشمگیری با کارآمدی بالاتر و دقت بیشتری عرضه می‎شود. سیستم‏های بیوانفورماتیک جزء اصلی فرآیند توالی‎ یابی هستند. بیوانفورماتیک، خروجی توالی را از طریق تجزیه‌وتحلیل محاسبات تفسیر کرده و سپس آن را تبدیل به اطلاعات مفید در مورد گونه‎ ها، ژنوتیپ‎ ها و وقوع جهش‏هایی که موجب بیماری یا مقاومت در برابر داروهای ضدویروسی می‎شود، می‎کند.

در حال حاضر روش Pyrosequencing روش منتخب در بین روش‌های NGS به حساب می‌آید. اساس این روش بدین گونه است که هنگام ورود نوکلئوتیدها به فرآیند پلیمریزاسیون DNA، مولکول‏های پیرو فسفات (PPi) تولید و رها می‌شوند. در ادامه PPi با کاتالیزور نوری لوسیفراز ترکیب و تولید نور کرده و در نهایت نور جمع‌آوری‌شده ثبت می‌شود. اگرچه پلت فرم Illumina به‌عنوان رایج‎ترین نوع این روش مورد استفاده قرار می‎گیرد، اما FLX۴۵۴ تولیدی شرکت Roche، اولین تحلیل‌گر قابل‌عرضه با کارایی جامع در بازار بوده است و برای تعیین گونه‎ها، زیرگونه ‎ها و واریانت‌های ویروس پاپیلومای انسانی (HPV) موجود در نمونه‌های دهانه رحم استفاده شده است. انواع دیگر سیستم‎ها، یون‎های هیدروژن آزادشده طی ورود نوکلئوتیدها به واکنش را شناسایی می‏کنند.

درک تغییرات ژنتیکی ویروس‌ها با استفاده از تولید حجم بالای داده های توالی یابی، امکان جمع‌آوری پایگاه داده های نوکلئوتید ویروسی و کسب توالی‎های جدید، فراهم شده است. اولویت جهانی ایدز به‌عنوان یک عامل اندمیک خطرناک و نرخ بالای جهش در این ویروس، باعث شده است تا بیشترین توالی یابی‏های انجام‌شده مربوط به این پاتوژن باشد.

برخلاف PCR و یا آزمایش‌های سرولوژیکی رایج، تاکنون تنها روش‎های توالی‎ یابی ژنی قادر به انجام ژنوتیپ HBV شده ‎اند، بنابراین توالی‎یابی به مدیریت بالینی بهتر عفونت HBV و عوارض مرتبط با آن کمک زیادی می‎کند.

با توجه به این‌که در اکثر مطالعات تئوری و بالینی، جهش‏های مقاوم در برابر داروها مطرح و موردتوجه است، لذا در رویکردهای فنی اخیر تجزیه‌وتحلیل داده‏ها و تنظیم سیستم‌های خوانش نرم‌افزار بر اساس تشخیص همزمان ژنوتیپ‌ها و جهش‎های پراهمیت بالینی و توالی‌یابی نسبی ژن HBV S با حساسیت بالای (۹۸/۶۴٪)، صورت می‏گیرد. بااین‌وجود، NGS در آزمایشگاه‎های بالینی به‌خصوص برای تشخیص الگوهای مقاومت دارویی با شیوع کمتر مانند HIV و HCV استفاده زیادی دارد. توالی‎ یابی نوکلئوتیدهای مناطق جزئی ژنوم HCV اکنون گزینه‎ ی انتخابی برای انجام تایپ‎ بندی ژنوم این پاتوژن است.

محدودیت‏ها

در کنار سیستم‏های مدیریتی مناسب برای ذخیره‌سازی داده‌های تولیدشده، انجام NGS مستلزم دسترسی به دستگاه توالی‌خوان و مهارت‎های قابل‌توجه در بیوانفورماتیک و تخصص در تجزیه‌وتحلیل داده‌ها است، علاوه بر این، علیرغم نتایج برجسته‎ ای که توسط نمونه‏ های اولیه در آزمایشگاه‎ها ارائه شده است، بسیاری از آنها هنوز در سطح تحقیقاتی قرار دارند و برای استفاده‎ ی روزمره در بالین مجوز ندارند.

مسلماً NGS یک تکنولوژی کلیدی در آزمایشگاه‌های بالینی تخصصی است، اما هنوز به دلایل محدودیت منابع در تهیه دستگاه آنالیزور توالی، آماده‌سازی آزمایشگاه و نمونه و همچنین عدم توانایی پرداخت هزینه‏ ی تست توسط مردم، اجرای NGS در بسیاری از کشورها با مشکل مواجه شده است.

اسپکترومتری جرمی (MS)

اسپکترومتری جرمی در حال حاضر یک معیار مهم در بررسی آزمایشگاهی کیفی و کمی، به‌ویژه در حوزه‎ی باکتری‌شناسی است. اساس اسپکترومتری جرمی مبتنی بر تبدیل نمونه به ذرات باردار (یون) توسط فرآیند یونیزاسیون است، در ادامه این یون‏ها بر اساس نسبت جرم به بار (m/z) جداسازی و توسط یک آشکارساز آنالیز می‌شوند. نتیجه به‌دست‌آمده با پایگاه داده مرجع (کتابخانه) موجود در سیستم، مقایسه شده و در قالب یک طیف (نمودار) قابل تفسیر عرضه می‌شود.

در آزمایشگاه‌های بالینی، روش‏های (MALDI) matrix-assisted laser desorption ionization  و   (ES)  electroscopy به دلیل پردازش مقادیر قابل‌توجهی از آنالیت، بیشترین موارد استفاده را در بین روش‌های یونیزاسیون دارند. جهت افزایش حساسیت، این روش‏های تجربی به‌تنهایی یا همراه با روش‏های مولکولی دیگر مانند PCR به‌طور وسیع مورد بررسی قرار گرفته و نتایج بسیار خوبی را ارائه داده‏اند. ترکیب این روش‏ها (RT-PCR /ESI-MS) قادر به تشخیص پاتوژن‏های ویروسی است که معمولاً با روش‏های معمول آزمایشگاهی شناسایی نمی‏شوند. این روش‏ها همچنین داده‏ های سریع و دقیق (گونه و زیرگونه‌ها) را در یک زمان کوتاه تولید می‏کنند.

یک ابزار کلیدی در مدیریت شیوع بیماری آنفلوانزا A، تشخیص تغییرات ژنتیکی یا جهش‏ها با استفاده از MALDI-TOF بوده است. کاربرد اسپکترومتری جرمی در تحقیقات ساختاری بیومولکول‏ها نشان‌دهنده کارآیی بالای MALDI-TOF-MS همراه با نانوذرات مغناطیسی آنتی‌بادی در تشخیص ویروس‏های آنفلوانزا می‌باشد. نتایج بدست آمده از این روش ترکیبی همانند روش استاندارد طلایی مبتنی بر PCR است. سنجش چندگانه با استفاده از ترکیب دو ماشین قدرتمند (PCR-MS)، تشخیص مقاومت دارویی طی درمان ضدویروسی، وجود چندین ویروس در یک نمونه و همچنین عفونت‌های همزمان را ممکن می‏سازد.

علاقه شدید به MS MALDI-TOF در ویروس‌شناسی بالینی منجر به پیشرفت‏های تحقیقاتی در تشخیص هپاتیت B شده است. این روش نه‌تنها توانایی تشخیص سطوح نسبتاً پایین HBV (۱۰۰ نسخه DNA در میلی‌لیتر) را داشته است، بلکه امکان تشخیص جامع تا ۶۰ واریانت و ژنوتیپ HBV با هزینه پایین‌تر از ۱۰ دلار به ازای هر نمونه را نیز دارد. این روش برای تایپ‎بندی ژنوتیپ مورد استفاده قرار گرفته و هشت ژنوتیپ HBV و همچنین ژنوتیپ‏های جزئی HCV را که در سطح بسیار پایین بودند، به‌طور دقیق شناسایی کرده است.

روش‏های مبتنی بر اسپکترومتری جرمی چندمنظوره، حساس، سریع و مقرون به‌صرفه هستند و نیازی به نرم‌افزار تفسیر تجزیه‌وتحلیل داده‏ها ندارند. اتوماتیک بودن ماشین‌آلات، این تکنیک آماده سازی نمونه‌ها را آسان نموده و در نتیجه به اپراتورهای کمتری نیاز است. ظرفیت آنالیز می‏تواند به ۹۶۰ نمونه در روز برسد که برای تشخیص روزمره در آزمایشگاه‌های بزرگ و مطالعات گسترده مناسب می‌باشد. همچنین می‏توان آزمایش‏ها را با کارایی مؤثر بر روی نمونه‌های بایگانی‌شده انجام داد.

محدودیت‏ها

محدودیت اصلی اسپکترومتری جرمی، هزینه‏های بالای آن به‌ویژه در مناطق پاندمیک بالا که معمولاً افراد تهی‌دست هستند، بوده، در نتیجه همه آزمایشگاه‎ها نمی‎توانند یک آنالیزور جرمی برای فعالیت‏هایشان داشته باشند. دومین اشکال مهم این روش در کتابخانه مرجع است. شناسایی تنها محدود به داده‏ های معین از ارگانیسم‎های شناخته‌شده است، بنابراین، اگر توالی‎های هدف در پلتفرم خوانش وجود نداشته باشند، جهش‏های نادر را نمی‎توان تشخیص داد. اما این‌که کتابخانه‏ های پایگاه داده اسپکترومتری جرمی به‌سرعت در حال گسترش هستند، امیدوارکننده است.

مزایای روش‏های جدید

• حساسیت و اختصاصیت تست‏ها نزدیک به ۱۰۰% است.
• امکان افزایش قابلیت تشخیص و صحت، طی ترکیب روش‏های مختلف در یک آزمایش (PCR-MS، PCR مبتنی بر تکنولوژی تراشه‏ های میکروفلوئیدیسی و …)
• اتومات شدن تست‎ها، تعداد اپراتورها و حجم کارهای دستی را کاهش می‎دهد.
• حجم کوچکی از نمونه موردنیاز است، بنابراین هنوز تست‎ها می‎توانند روی نمونه‏ های خاص انجام شوند (CSF، نوزادان و غیره)
• بعضی از تست‏ها مانند اسپکترومتری جرمی حتی پس از چندین مرتبه فریز و ذوب کردن نمونه ها (نمونه‎ های آرشیوشده) باز هم کارایی خود را حفظ می‎کنند.
• دوره کاری سریع: حداقل زمان لازم برای جمع‌آوری نمونه تا گزارش نتایج ۳۰ دقیقه است و ابزارهای ریز‎آرایه قادر به پاسخ‎گویی نتایج در عرض چند ثانیه هستند.
• حد تشخیص پایین: PCR قادر به تشخیص ۱۰ الی ۱۰۰ نسخه از توالی هدف به ازای هر میلی‌لیتر از نمونه است.
• واکنش‎های چندگانه: تشخیص طیف گسترده‎ ای از پاتوژن‎ها در یک دوره ی کاری، صرفه‌جویی در وقت را به دنبال دارد.
• امکان تشخیص موارد نادر مقاوم در برابر داروها وجود دارد.
• NGS مقدار زیادی داده توالی‎یابی را در هر دوره‌ی کاری تولید کرده و قابلیت خوانش توالی‎های طویل را دارد.
• هزینه ی کم تست هنگام استفاده از تراشه‏ های میکروفلوئیدس و درنتیجه سهولت استفاده از آنها در تأسیس مراکز مراقبت‎های ویژه
• کاهش خطر آلودگی با استفاده از انجام چندین تست در یک لوله‎ ی آزمایش

آخرین تکنولوژی‌ها در جوامع  با منابع محدود

روش‎های شرح داده‌شده در فوق، عملکرد قابل‌توجهی در نجات زندگی هزاران نفر در کشورهای توسعه‌یافته داشته‌اند، بااین‌حال، مشکل در تهیه‏ ی این تجهیزات و تجربه‏ های فنی برای تشخیص دقیق در مراکز با منابع محدود، همچنان پابرجا است. درحالی‌که ابزارهای گران‌قیمت مانند سیستم‌های PCR محور یا آنالیزورهای جرمی فقط در آزمایشگاه‎های مرجع یا در مراکز نظامی وجود دارند، دسترسی به دستگاه‎های تست در مراکز مراقبت‎های ویژه یا درمانگاه‎های نزدیک به محل زندگی بیماران که بیش از ۸۰ درصد از جمعیت فقیر را در اختیار دارند، با مشکل مواجه است، به‌عنوان مثال، سازمان بهداشت جهانی دستورالعمل‏هایی را برای نظارت بر اثربخشی داروهای ضد رتروویروس در بیماران مبتلا به HIV-۱ در کشورهای در حال توسعه تنها با اکتفا به شمارش تعداد سلول‎های +CD۴  و آزمایش ELISA به‌عنوان جایگزین تست‏های گران‌قیمت ایجاد کرده است. به‌جای سنجش میزان لود ویروسی، مقدار آنتی‌ژن p۲۴ و فعالیت ترانس‌کریپتاز معکوس به‌ترتیب توسط روش فوق‌حساس p۲۴ و آزمون ExaVir اندازه گیری می‏شود. متأسفانه عدم حساسیت آنها باعث درمان ناموفق و پیدایش سویه‏ های مقاوم شده است.

یکی دیگر از موارد هزینه ‎بر مدیریتی در کشورهای فقیر، بیماری هپاتیت بوده که انجام ارزیابی دقیق مشخصات اپیدمیولوژیک آن مشکل است. در مورد HBV، بیشتر مراکز مراقبت‏های ویژه تنها به غربالگری HBsAg با استفاده از تست‎های تشخیص سریع اکتفا می‎کنند. چنین دستگاه‏های کم‌هزینه‌ای، توانایی تعیین روند بیماری برای اطلاع از اینکه آیا شروع یک درمان ضدویروس لازم است یا خیر، را ندارند.

اتوماسیون، میکروفلوئیدس و چشم‌اندازهای آینده

ارائه نظارت اپیدمیولوژیک در سطح بالا روی بیماری‎های ویروسی، بی‌تردید یک خواسته سلامت عمومی جهانی است. در سال‎های اخیر با وجود پیشرفت سریع در توسعه روش‏های تشخیصی، همچنان نیاز به بهبود هزینه ها، اندازه‎ ها و زمان دوره ی کاری حس می‏شود.

بعد از تب خونریزی دهنده‏ی ابولا در سال ۲۰۱۴، وزارت انرژی ایالات متحده آمریکا به توسعه یک تست نوآورانه سریع و قابل‌حمل برای شناسایی اختصاصی ویروس ابولا در عرض چند ثانیه پرداخته است.   این تست  سایر RNA و اگزوتیک  ویروس‏ها    مانند Dengue و West Nile را هم هدف گرفته است. نمونه‏ های دیگر شامل سیستم‎های کاملاً وابسته به تست‌های تکثیر نوکلئیک اسیدی و همچنین بکار گرفتن تکنولوژی نانومنفذ در دستگاه‏های کوچک برای انجام توالی‌یابی DNA تک‌مولکولی است.

میکروفلوئیدس به‌عنوان یک تکنولوژی امیدوارکننده، برای مدیریت بیماری‎های عفونی طی درمان به‌موقع در نظر گرفته شده است. تکنولوژی میکروفلوئیدسیک راه حل کلیدی بالقوه برای مناطق دورافتاده و مراکز خدماتی نزدیک به بیماران بدون نیاز به رفت‌وآمد بیماران بین درمانگاه و آزمایشگاه است. استفاده از این تکنولوژی در صورت حیاتی بودن مؤلفه ی زمان یا در مواردی که فضای فیزیکی کافی برای راه‌اندازی روش‎های مرسوم وجود ندارد، سودمند است.

آزمایش روی تراشه (LOC) یک دستگاه بسیار کوچک است که فرآیندهای آزمایشگاهی را در   چند سانتیمتر مربع ممکن  میسازد. این دستگاه از حجم بسیار کمی از نمونه‌ها برای انجام واکنش سریع در داخل تراشه یا یک دستگاه قابل‌حمل استفاده می‎کند. ازآنجاکه واکنش‏ها با انواع تکثیر و تشخیص اسید نوکلئیک، شمارش سلولی و ایمنی‌سنجی متفاوت است، انجام تست‎‏های آزمایشگاهی تشخیص میکرو‎فلوئیدیسی در مقایسه با ابزارهای بزرگ، هزینه‌ی کمتری لازم دارد و به نفع تأسیس مراکز کم‌درآمد و مناطق دورافتاده است.

طیف گسترده‌ای از دستگاه‏های LOC توسط سازمان غذا و دارو در تشخیص عفونت‌های ویروسی مانند آنفلوانزا، HIV و HBV تأیید شده و توسعه‎ ی بیشتر آنها در حال انجام است، به‌عنوان مثال در کشورهای در حال توسعه، روش تشخیصی Daktari از کروماتوگرافی جذبی برای شمارش سلول‏های CD۴ + T به‌عنوان جایگزین فلوسایتومتری برای ردیابی HIV استفاده می‎کند. آنالایزور رومیزی GeneXpert ساخته‌شده توسط Cepheid یک سیستم یکپارچه حاوی آماده‌سازی نمونه و PCR برای تشخیص مولکولی آنفلوانزا و سایر عفونت‎های باکتریایی است که در فرمت بسیار سبک و قابل‌حمل طراحی شده است.

الزامات درستی یک تشخیص، شامل بهبود برنامه‎ های کنترل و تضمین کیفیت و استانداردسازی آزمون‏ها، کیت‎ها و واکنش‌ها است. قبل از تأیید آزمایش‌های بیشتر، مرکز کنترل و پیشگیری از بیماری‌ها (CDC) به‌طور پیوسته دستورالعمل‎های تست‎های آزمایشگاهی را مخصوصاً برای HIV تدوین و پیاده‌سازی می‎کند.

مؤسسات سازمان بهداشت جهانی و سازمان‏های غیرانتفاعی از جمله بنیاد تشخیص‎های ابتکاری جدید (FIND)، هدف خود را بر مبنای به حداکثر رساندن تلاش در اجرای برنامه‌های نظارتی، کنترل بیماری‏های مسری، ایجاد سیاست‏های جدید و بهبود خدمات تشخیصی در مراکز با منابع محدود گذاشته‌اند.

نتیجه‏ گیری

امروزه روش‎های تشخیص ویروسی، تغییراتی را در زمینه میکروب‎شناسی بالینی ایجاد کرده و می‌تواند به کاهش شیوع بیماری‏های شدید عفونی کمک کند، بااین‌حال توانایی‎های فنی به‌تنهایی کافی نبوده و حمایت استراتژی‎های ارتقاء سلامت به‌منظور افزایش آگاهی در مورد اهمیت تشخیص زودهنگام و غربالگری منظم افرادی که در معرض خطر هستند، الزامی است.

در نهایت، تشخیص با کیفیت خوب نیازمند هزینه است که فقط کشورهای توسعه‌یافته قادر به تأمین روزمره‎ی آن هستند، بنابراین کمبود هزینه باعث به تأخیر افتادن اجرای روش‎های جدید در کشورهای در حال توسعه و مناطق اندمیک شده است. بااین‌حال این امید وجود دارد که همچنان تلاش‎ها برای توسعه تست‌های جدید با کیفیت خوب و قیمت‏های پایین در کشورهای کم‌درآمد ادامه پیدا کند که این امر به‌نوبه‌ی خود تقویت تدریجی راهکارهای کنترل بیماری را در این کشورها به دنبال خواهد داشت.

فراپژوهش