تکنیک PCR ایزوترمال ۱۶۱ طولانی

مقدمه

روش‌های تکثیر اسیدهای نوکلئیک جایگاه ویژه‌ای در فرایندهای تحقیقاتی دارند. قبل از ابداع روش‌های مولکولی تکثیر، برای به دست آوردن نسخه‌های متعدد از یک ژن می‌بایست ژن خاص را به داخل حامل (carrier) مناسب وارد کرده (باکتری E.Coli) تا تکثیر پیدا کند. امروزه یکی از شناخته‌شده‌ترین روش‌های مولکولی تکثیر، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) است که به دلیل سادگی و کاربردها و مزیت‌های بسیار زیاد به‌سرعت گسترش یافته است. اگرچه PCR به‌صورت گسترده و متداول توسط محققین در آزمایشگاه‌های زیست مولکولی به کار می‌رود اما نیازمند استفاده از دستگاهی است که به‌صورت چرخه‌ای سیکل‌های دمایی مناسب را برای هر مرحله از واکنش فراهم کند. پیشرفت‌های اخیر در توسعه‌ی تکنیک‌های مولکولی نشان‌دهنده‌ی این است که می‌توان اسید نوکلئیک هدف را در دمای واحد (ایزوترمال) بدون نیاز به دستگاه ترموسایکلر تکثیر داد.

خلاصه‌ی واکنش زنجیره‌ای پلیمرازی:

مرحله یک: دناتوراسیون DNA دو رشته‌ای الگو توسط حرارت

مرحله دو: اتصال پرایمر فوروارد و رورس به DNA الگوی تک‌رشته‌ای در دمای ویژه

مرحله سه: همانندسازی و تکثیر DNA الگو توسط آنزیم پلیمرازی مقاوم به حرارت

نکته: چنانکه اسید نوکلئیک هدف RNA تک‌رشته‌ای باشد ابتدا باید با تکنیک پی سی ار ترنسکریپتاز معکوس به cDNA تبدیل شود.

انواع تکنیک‌های تکثیر اسید نوکلئیک هدف در دمای ثابت (ایزوترمال):

۱- NASBA ( Nucleic acid sequence based amplification): تکثیر مبتنی بر توالی ویژه‌ای از اسید نوکلئیک

۲- TMA (Transcription-mediated amplifcation ) یا (self-sustained sequence replication ): تکثیر به‌واسطه‌ی رونویسی

۳- SDA (Strand displacement amplification): تکثیر به‌واسطه‌ی جا به جایی رشته

۴- (Isothermal multiple displacement amplification ) IMDA: تکثیر ایزوترمال به‌واسطه جا به جابی چندگانه

۵- RCA (Rolling circle amplification): همانندسازی به روش حلقه‌ی چرخان

۶- LAMP(Loop mediated isothermal amplification): تکثیر هم‌دمایی به‌واسطه حلقه

۷- HAD (Helicase-dependent isothermal DNA amplification): همانندسازی وابسته به هلیکاز

۸- RPA (Recombinase polymerase amplification): تکثیر با آنزیم پلیمراز ریکامبیناز

۹- SPIA (Single primer isothermal amplification): تکثیر ایزوترمال با یک آغازگر (پرایمر)

هر کدام از روش‌های تکثیری ایزوترمال فوق از کاربرد ویژه‌ای برخوردارند.

تکنیک ایزوترمال NASBA یک تکنیک مبتنی بر رونویسی جهت تشخیص RNA هدف است. در این تکنیک، سیستم تکثیری از سه آنزیم Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase(AMV)،  RNaseH و پلیمراز  T۷ RNA(T۷ DNA dependent RNA polymerase) تشکیل شده است.

این تکنیک در سال ۱۹۹۱ توسط Compton ابداع شد.

کل واکنش در دمای ایزوترمال °C ۴۱ انجام می‌شود.

به دلیل اینکه تکثیر در این سیستم مبتنی بر رونویسی است نمونه‌های هدف معمولاً RNA ژنومی، mRNA و rRNA می‌باشد.

سازمان غذا و داروی آمریکا (FDA) روش تشخیص مولکولی برخی از میکروارگانیسم‌ها مانند HCV و HIV-۱ را به روش NucliSence (NASBA-ECL)  تائید کرده است.

Life Sciences Advanced Technologies (شرکت فن‌آوری‌های پیشرفته علوم زیستی) از سال ۱۹۶۲ میلادی به‌عنوان شرکت تولید کننده پیشرو، در تجارت بین‌المللی آنزیم ترنسکریپتاز معکوس AMV است.

شرکت Life Sciences Advanced Technologies بیش از ۲۰ سال, پیشرو در تولید کیت‌ها و معرف‌های NASBA بوده است.

SKU: NEC-۱-۲۴ (NASBA Enzyme Cocktail (wet mix))

این کیت آنزیمی شامل آنزیم ترنسکریپتاز معکوس ویروس آویان میلو بلاستوزیز(AMV RT)، RNase H  و T۷ RNA پلیمراز است.

ترکیبات واکنش NASBA:

• AMV RT
• RNase H
• T۷ RNAP
• BSA
• High MW sugar matrix

کل حجم واکنش کیت ۱۲۰ میکرولیتر می‌باشد که به مقدار ۵ میکرولیتر به ازای هر یک واکنش طراحی شده است پس در نتیجه این کیت برای ۲۴ واکنش قابل‌استفاده است.

نکته: دمای نگهداری اجزای داخل کیت -۲۰ تا  -۷۰ درجه سانتی گراد می‌باشد.

ویژگی‌های تکنیک NASBA:

۱) تکنیک تکثیری ایزوترمال تک‌مرحله‌ای در دمای °C ۴۱

۲) آنالیت‌های RNA به دلیل حضور آنزیم رورس ترنسکریپتاز، الگوی هدف مناسبی برای این تکنیک محسوب می‌شود.

اساس تکنیک:

در مرحله‌یک، توالی پرایمری P۱ (پرایمر آنتی‌سنس) که حاوی پروموتر T۷ پلیمراز است RNA الگو را مورد هدف قرار می‌دهد. در مرحله‌ی دو، پرایمر به‌ توالی هدف متصل می‌شود. در مرحله سه، آنزیم رورس ترنسکریپتاز با رونویسی معکوس از روی RNA هدف،  cDNA (complement DNA) سنتز می‌کند. در مرحله چهار، RNase H با خاصیت اگزونوکلئازی، رشته‌های RNA هدف هیبرید شده با cDNA را تجزیه می‌کند. سپس در مرحله پنچ، پرایمر P۲(پرایمر سنس) که پروموتر T۷ را دارد به ‌توالی خاصی از DNA تک‌رشته‌ای تازه سنتز شده (cDNA) متصل می‌شود. در مرحله شش، cDNA توسط آنزیم رورس ترنسکریپتاز همانندسازی می‌شود که نتیجه تشکیل DNA دو رشته‌ای (dsDNA)است. در مرحله هفت، dsDNA تشکیل شده که توالی پروموتری مختص آنزیم T۷ RNA پلیمراز را روی خود دارد توسط آنزیم T۷ RNA پلیمراز، تک رشته‌های RNA سنس را سنتز می‌کند. هر یک ازRNA های سنتز شده می‌تواند دوباره در این مراحل شرکت کند و بدین ترتیب چرخه‌ی تولید RNAهای تک‌رشته‌ای تکرار می‌شود و امپلیکونهای بیشتری از RNA الگو تولید می‌شود.

تصویر شماتیک از مراحل NASBA PCR

راندمان و سرعت تکثیر: با این روش در کمتر از ۲ ساعت، RNA هدف بیش از ۱۰^۹ برابر تکثیر می‌شود.

نکات ویژه‌ی تکنیک NASBA

در این تکنیک از دو پرایمر اختصاصی P۱ و P۲ استفاده می‌شود.

۱- پرایمر P۱ در انتهای ´۵ خود توالی متصل شونده به آنزیم  T۷RNA پلیمراز را دارد. وجود توالی پروموتری T۷ در انتهای ´۵ پرایمر P۱ (پرایمر Forward) ضروری می‌باشد تا توسط آنزیم T۷DdRp(DNA dependent RNA polymerase) رونویسی شود.

۲- پرایمر دوم P۲ (Reverse) در انتهای ´۵ خود یک توالی غیراختصاصی دارد که در مرحله‌ی تشخیص و شناسایی محصولات تکثیرشده توسط تکنیک الکتروکمیلومینسانس (ECL) شناسایی می‌شود.

۳- پرایمرهای طراحی شده باید اختصاصی توالی هدف در اسید نوکلئیک باشند. جهت افزایش اختصاصیت در اتصال، طول نوکلئوتیدی ناحیه‌ی اتصالی پرایمر با توالی هدف باید ۲۰-۳۰ نوکلئوتید باشد و غلظت بازهای G و C بین ۴۰-۶۰% باشد.

روش‌های تشخیص و شناسایی محصولات تکثیر یافته با تکنیک NASBA

۱- محصولات تکثیر یافته با این تکنیک، RNA تک‌رشته‌ای است که تشخیص این محصولات با تکنیک الکتروفورز ژل آگارز و رنگ‌آمیزی اتیدیوم بروماید همراه است؛ اما ازآنجایی‌که RNA تک‌رشته‌ای ساختارهای ثانویه تشکیل می‌دهد از دناتوره کننده‌های فرمالدهید و گلی اکسال به همراه DMSO استفاده می‌شود.

۲- روش الکتروکمیلومینسانس (Electro-chemiluminescence) با اختصاصیت و کارایی بالا برای شناسایی محصولات تکثیر یافته مورداستفاده قرار می‌گیرد.

۳- استفاده از ژل حاوی آنزیم ELGA (Enzyme linked gel assay). در این روش از آنزیم horseradish peroxidase استفاده می‌شود.

۴- طیف‌سنجی فلورسنس Fluorescence correlation spectroscopy با استفاده از پروب‌های فلورسنت

۵- تکنولوژی molecular beacons: رایج‌ترین روش شناسایی  molecular beacons الیگونوکلئوتیدی از جنس DNA است که به انتهای ۵´ مولکول فلورسنته به نام فلوروفور و به انتهای ۳´ مولکول خاموش‌کننده‌ی نور فلورسنت به نام کوینچر متصل شده است. انتهای ۳´ و ۵´ الیگو نوکلئوتید مکمل یکدیگر هستند و در نبود محصولات تکثیر یافته‌ی اختصاصی مکمل با توالی الیگونوکلئوتیدی، این دو انتها به هم متصل شده و ساختار ساقه-حلقه(stem-loop)  تشکیل می‌شود و در نتیجه نور فلورسنت نشر نمی‌شود؛ اما در صورت انجام واکنش و تولید محصولات اختصاصی، انتهای ۵´ از ۳´ فاصله گرفته و نور فلورسنت نشر می‌شود. میزان نور فلورسنت نشر شده با دستگاه فلورومتر سنجیده می‌شود. بدین ترتیب به تولید محصول اختصاصی پی برده می‌شود.

تکنولوژی molecular beacons

بهینه‌سازی شرایط واکنش NASBA

در این تکنیک جهت افزایش اختصاصیت اتصال پرایمر به‌توالی هدف، پتاسیم کلراید با اپتیمم غلظت ۴۰ میلی مولار به مخلوط واکنش افزوده می‌شود.

مزایا و معایب: